基于水凝胶挤出/聚合物近场直写复合工艺的4D生物打印

在组织工程中，尽管生物3D打印制造技术具有巨大潜力，但在某些特殊结构的制造上仍然存在缺陷。例如空心管状结构，传统的旋转打印法很难将柔软且小直径的结构从轴上完好无损的取下，细胞的接种也由于重力原理难以均匀分布。此外在神经导管、血管等应用场景中还需要细胞具有定向排列的效果，这些都是传统3D打印难以克服的挑战。为此，德国拜罗伊特大学的Leonid Ionov课题组在ACS Applied Materials & Interfaces发表题为4D Biofabrication Using a Combination of 3D Printing and Melt-Electrowriting of Shape-Morphing Polymers的论文，研究提出一种4D生物打印，膜片状的水凝胶可在相应溶液中自动卷曲，形成尺寸可控的小直径管状结构，结合的近场直写纤维可以引导细胞产生定向效果。

研究人员先采用挤出打印工艺，将含光引发剂的甲基丙烯酸海藻酸盐凝胶(AA-MA)打印成圆形膜片，经过紫外光固化干燥后，再表面上利用近场直写将PCL纤维定向沉积在凝胶表面。将双层结构置于含细胞的溶液中，并且由特氟龙环固定，防止在溶液中产生卷曲。由于海藻酸盐具有对钙离子的高灵敏度，因此钙离子浓度可以作为触发并控制形变的刺激因素。最后将环去除，凝胶结构产生卷曲，如Figure1。

图1 4D打印双层结构管示意图

研究人员对两种工艺分别进行研究，首先对AA-MA层的力学性能和溶胀性能进行了定量研究，以了解光引发剂浓度和交联时间的影响，如Figure2。随着IRG2959浓度的增加和交联时间的延长，形成的凝胶片的弹性模量增大。在水环境中，由于紫外光照射导致交联密度梯度，导致不均匀膨胀，因此海藻酸盐层能够卷成管/卷轴。通过实验观察到，管径随着弹性模量的增加而减小。值得注意的是，水凝胶的弹性模量接近于肌肉组织的弹性模量。

图2 光交联凝胶AA-MA的力学性能

其次研究人员研究了PCL近场直写工艺，如Figure3，在合适的工艺参数下，产生的纤维直径可达12-17μm，与天然ECM中胶原纤维的直径相当(1-20μm)。在对纤维进行电子显微镜和x射线散射的微观研究中，研究人员观察到沿纤维形成的球晶，其平均尺寸为22±8μm。值得注意的是，传统静电纺丝得到的200 nm厚的纤维中没有观察到球晶的形成。这个现象说明近场直写的PCL纤维并不像普通纤维那样被拉长，加热至37℃后也不会观察到类似传统静电纺丝纤维的收缩现象。

图3 近场直写PCL纤维的相关表征

接下来，作者研究了AA-MA/PCL双层膜的性能。将两层AA-MA层叠印在一起，以0.1%的光引发剂浓度将它们光交联15分钟，然后沉积几层PCL纤维来改变PCL和AA-MA层的厚度比例。双层膜在无钙水溶液中滚动并形成管状，而钙盐的加入导致了双分子层的展开。此外，EDTA的加入也可导致已展开的双层膜再次卷曲。通过改变介质中Ca2+离子的浓度和PCL/AA-MA的厚度比，可以精确地控制形成的管的直径

图4 双层结构形变性能表征

双层膜的形状对变形的方向有较大的影响，如Figure5。以PCL纤维的三种折叠情况方向为例:平行、对角、垂直。对于矩形可以观察到大多是垂直折叠的(66%)，而没有观察到对角折叠。有趣的是，对于圆形的，超过50%与纤维平行弯曲，进行对角线和垂直折叠的圆形双层的比例相同，约为20%。可能由于对称的圆形形状，边缘产生的应变力减小，从而出现更多的平行折叠。相对于纤维的取向而言，PCL纤维没有明显的首选折叠方向，这表明PCL纤维对AA-MA层的折叠影响较小。

图5 AA-MA/PCL双层材料的折叠方向

最后，研究人员在打印双层结构上进行了细胞实验，如Figure6。实验显示，AA-MA膜和双层膜上的细胞代谢率随时间增加。但双层膜的代谢活性的增加速率要高于AA-MA

图6 纯AA-MA膜与双层膜的细胞活死实验结果

由于PCL纤维的存在，相对纯AA-MA的组别，接种在双层支架上的细胞产生高度排列。但是随着时间的推移，细胞聚集并形成簇，减少了细胞排列程度。这可能是因为藻酸盐是一种亲水材料，对蛋白质的吸附能力较低，从而降低了膜细胞蛋白质和材料之间的粘附。

图7 细胞在纯AA-MA膜与双层膜的取向分布

总结，本文提出了一种4D打印结构，能在溶液中产生卷曲形成管状。通过结合传统水凝胶挤出与近场直写，复合结构能使接种的细胞产生高度的定向效果。因此，基于水凝胶3D打印和熔融聚合物纤维直写相结合的4D打印方法在需要细胞单轴定向的组织工程中具有很大的应用前景。

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