西工大张秋禹团队ACS Nano：基于Ti3C2Tx MXene的导电抗菌止血多功能支架，用于促进多药耐药细菌感染的伤口愈合！

细菌感染是伤口愈合/皮肤再生过程中最常遇到的问题，严重的炎症反应明显增加了伤口感染引起的疾病数量，降低了伤口愈合的质量。另外，由细菌感染引起的慢性伤口的治疗是医疗系统和患者的重大负担。临床上感染性伤口的治疗策略主要是使用抗生素。然而，由于耐药性和缺乏合适的伤口修复微环境，抗感染和伤口愈合的治疗效果并不理想。因此，非常必要开发一种可抵御多药耐药性细菌感染并同时促进感染性伤口愈合/皮肤再生的多功能治疗策略。

近日，西北工业大学张秋禹教授团队设计了自愈合，导电和组织粘附性的2D Ti₃C₂Tx MXene基支架（HPEM），该支架具有较强的止血能力，良好的生物相容性和促进MRSA感染性伤口愈合的能力。在体外和体内对HPEM支架的制备，多功能特性和生物医学应用进行了全面评估。相关工作以“Conductive Antibacterial Hemostatic Multifunctional Scaffolds Based on Ti₃C₂Tx MXene Nanosheets for Promoting Multidrug-Resistant Bacteria-Infected Wound Healing”为题发表在《ACS Nano》上。

【HPEM支架的设计与合成】首先制备氧化透明质酸（HCHO）和聚多巴胺包覆的Ti₃C₂T_x MXene纳米片（MXene@PDA），并通过迈克尔加成将低分子量的聚乙烯亚胺（PEI）与甘油三丙烯酸酯（GTA）反应制备支化的PGE聚合物。然后，通过PGE的氨基，HCHO的醛基和MXene@PDA的酮羰基之间的席夫碱反应制备HPEM支架。

HPEM支架的制备及其在多药耐药细菌感染的伤口愈合中的应用

分别使用¹H NMR、FTIR、SEM、TEM和EDS能谱表征原料及HPEM支架的结构特征，证明了多孔HPEM支架的成功制备。

支架的结构表征

【多功能特性表征】研究人员对HPEM支架的流变特性，自修复能力，导电性和粘附能力进行了表征。即使在4^oC时，HPEM的储能模量仍高于对照HPE的储能模量，表明MXene@PDA参与了HPEM支架网络的形成。通过测定在1％至1000％的剪切应变下的G 和G 来评价HPEM支架的剪切稀化效应和自愈合性能，并证实了HPEM支架是通过席夫碱反应制备而成而不是简单混合形成。此外，被切成两块的HPEM支架在放置2分钟后可以快速愈合，进一步证明了HPEM支架因其网络中的动态席夫碱键而具有良好的自愈性。HPEM支架在室温下放置24小时后仍可保持凝胶状态，表明其良好的稳定性。随着放置时间的延长，网络中的动态席夫碱键开始断裂。放置36小时后，在支架中可观察到一些液体存在。48小时后，由于支架网络中席夫碱键的完全断裂，HPEM变成了溶液状态。此外，由于掺入了高导电性的MXene@PDA，HPEM的电导率（2.89±0.025 S / m）比HPE的（0.69±0.027 S / m）高很多。同时，HPEM对新鲜猪皮的正应力在所有测试组中最高，表明其具有更好的组织粘附能力。上述结果表明，由于其较好的自愈合能力，皮肤粘附能力和较高的电导率，HPEM支架作为用于感染性皮肤伤口修复的多功能敷料具有巨大的潜力。

支架的多功能特性评估

【抗菌活性和止血能力】使用细菌计数法测定HPEM支架对大肠杆菌（革兰氏阴性细菌），金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌活性。HPEM支架可以有效抑制超过98.6％的大肠杆菌和99.9％的金黄色葡萄球菌的生长，表明其具有良好的抗菌活性。而且，HPEM支架也能有效抑制对多种常用抗生素具有耐药性的MRSA，其对MRSA的抑菌效率（99.03％）与万古霉素（98.9％）相当，并远高于氨苄西林（44.8％）。使用小鼠出血性肝模型和尾巴出血时间测定法评估HPEM支架的止血能力。用HPEM支架处理5 s后，出血部位的出血得到了迅速控制。60 s后，对照组的失血量约为155.6±7.63 mg。HPEM组的失血量仅为24.4±5.39 mg。此外，与对照组相比，HPEM组的凝血时间明显减少，说明HPEM具有良好的止血能力。由于其较强的抗感染和止血能力，HPEM有望作为可促进感染性伤口愈合的多功能支架。

抗菌活性和止血能力测定

【毒性，细胞增殖和基因表达测定】在L929细胞中评估HPEM和对照组在5–25μg/mL浓度下的细胞毒性。结果表明：即使在25μg/mL的浓度下，处理L929细胞24小时后，HPEM和对照（PGE除外）均显示出较高的细胞活力（超过99％），表明HPEM支架具有较好的生物相容性。细胞增殖结果表明，所有组在以5μg/mL的浓度下共孵育1天后均显示出许多活细胞（绿色）。随后，由于共孵育3天和5天后活细胞数量明显增加，所有组均观察到了快速的细胞增殖。共孵育5天后，使用Alamar Blue试剂盒对细胞增殖进行定量分析。HPEM组的荧光强度最高，进一步证明了HPEM对细胞增殖的促进作用。可能的原因是，由于其优异的导电性，HPEM可以通过增强电传输来构建细胞通讯网络，从而上调相关基因的表达以促进细胞增殖。平滑肌α-肌动蛋白（α-actin）因可促进成纤维细胞的增殖和分化而在伤口愈合中起着至关重要的作用。此外，III型胶原蛋白（COL III）和血管内皮生长因子（VEGF）分别对肉芽组织重组，基底膜再生，血管内皮细胞迁移和伤口愈合过程中的血管生成非常重要。HPEM组中α-肌动蛋白的基因表达明显高于对照组，表明HPEM可以通过增加α-肌动蛋白的表达来促进细胞增殖。此外，各组中，HPEM组的COL III和VEGF的mRNA水平最高。这些结果表明，HPEM可能通过上调α-肌动蛋白，COL III和VEGF的基因表达来促进伤口愈合。

支架的细胞毒性和细胞增殖评估

【MRSA感染的伤口愈合评估】使用MRSA感染的全层皮肤伤口模型评估HPEM支架对感染性皮肤伤口的愈合能力。术后第3天，HPEM组的伤口尺寸比其他组的伤口小。同时，由于细菌感染，在3M组中观察到一些黄色脓液渗出。术后第7天，HPEM组的伤口面积显著减少，而HPE，3M和空白组的伤口面积仍分别高达66.2％，88.7％和62.8％。术后第14天，HPEM组的感染性伤口几乎完全愈合（伤口闭合率为96.31％），伤口部位基本上被新生的皮肤组织覆盖。相比之下，空白组和3M组的伤口被焦痂覆盖，而HPE组的愈合速度比这两个对照组稍快。上述结果表明，HPEM支架可以促进MRSA感染的伤口愈合。为了评估HPEM支架的体内抗菌能力，将术后第3–14天的伤口组织上的细菌在LB琼脂平板上培养。此外，对因细菌感染而局部募集的巨噬细胞和嗜中性粒细胞分别进行F4/80免疫荧光染色和Ly6G免疫组化分析，用于评估术后第3天各组中MRSA感染的严重程度。上述结果表明，HPEM支架可以在体内有效抵抗MRSA引起的感染并减少炎症反应，因此可加速细菌感染下的伤口愈合。使用H＆E染色和Masson三色染色分析愈合期间伤口样品的组织学形态。结果表明：HPEM支架可以通过加速肉芽组织的形成和增加胶原蛋白的沉积来促进感染性伤口的愈合过程。Ki67的免疫组化分析和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和CD31的免疫荧光染色分别用于研究术后第7天伤口组织的细胞增殖，血管生成反应和血管生成情况。上述结果表明：HPEM支架可以有效抵抗MRSA感染、促进肉芽组织形成、胶原蛋白沉积、细胞增殖、血管内皮分化和血管生成，并最终显著加速MRSA感染的伤口愈合过程。

体内抗感染和MRSA感染的伤口愈合

伤口愈合测定的免疫组化和免疫荧光染色分析