ACS Nano | 细菌来源的纳米体装饰纳米平台在放疗后恢复 T 细胞免疫

肿瘤免疫微环境内的 T 细胞耗尽（TIME）会削弱放射免疫疗法的疗效。本研究证明，X 射线放疗能诱导肿瘤微环境（TME）中的精氨酸代谢失调和 PD-L1 上调，抑制 T 细胞代谢，推动 PD-1⁺TIM-3⁺ 耗尽 T 细胞的扩增，从而促进免疫抑制。为此，我们设计了一种仿生混合免疫调节剂（arg/B^nb-L），通过工程化 BL-21 细菌膜展示 PD-L1 纳米抗体， 并将其与 l-精氨酸负载的脂质体融合。该纳米平台同时阻断 PD-1/PD-L1 免疫检查点信号，恢复 T 细胞代谢活性，同时促进树突状细胞成熟。在小鼠肿瘤模型中，Arg/B^nb-L 结合放疗显著增强 CD8⁺ T 细胞浸润，减少耗尽的 T 细胞群，维持细胞毒性 T 淋巴细胞功能，并抑制肿瘤进展和转移。我们的研究阐明了放射治疗诱导免疫抑制的双重机制，并提供了通过靶向代谢和免疫重编程提升放射免疫治疗效果的有前景策略。该研究以题为“Bacteria-Derived Nanobody-Decorated Nanoplatform Restores T Cell Immunity Post-Radiotherapy”发表在ACS Nano上。放疗后TIME中T细胞浸润及表型向衰竭的转变。(A) CD8 T细胞簇的统一流形近似和投影(UMAP)视图。(B) 按照对照组和放疗组分层的CD8 T细胞簇比例UMAP视图。(C) 两组的T细胞亚群。(D) 热图显示跨组织的元簇分布的优势比(OR)。OR > 1.5表示组织偏好。(E) 点图显示六个CD8 T细胞亚群的特征基因表达。点的大小和颜色分别表示表达细胞的比例和平均表达水平。(F) 轨迹分析显示对照组和放疗组T细胞状态的转变，突出从初始表型向效应及衰竭表型的转变。(G) CD8 T细胞簇中衰竭相关标志物的表达水平和频率。(H 和 I) GSEA图显示两个衰竭CD8亚群中选定通路的富集情况，包括LAG3 HAVCR2 CD8 T细胞(H)和CTLA4 PDCD1 CD8 T细胞(I)。数据以均值 ± SEM表示，统计学差异通过Student’s t检验显著。****p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05; NS, 无显著性。放射治疗引起的PD-L1上调和精氨酸代谢失调加剧了T细胞耗竭。(A) 建立接受6 Gy治疗的小鼠模型的示意图（G1: 对照，G2: 6 Gy）。(B) 通过流式细胞术分析PD-1⁺CD8⁺T耗竭细胞。(C) (B)中细胞比例的定量数据显示在图中（n = 3）。(D, E) 通过免疫荧光染色可视化耗竭T细胞浸润。(F) 在光学显微镜下拍摄CD8 T细胞。(G) PD-1的定量分析 L-精氨酸水平在肿瘤组织中检测（G1: 对照，G2: 6 Gy）（n = 3）。(I) PD-1⁺T耗竭细胞比例在图中显示（n = 3）。(H) 通过流式细胞术分析细胞（G1: 对照，G2: -精氨酸）。(J) (I)中细胞比例的定量数据显示在图中（n = 3）。(K) ATP产生水平被测量并显示在图中（n = 3）。(L) 通过流式细胞术分析PD-1⁺耗竭细胞（G1: 对照，G2: PD-L1）。(M) (L)中细胞比例的定量数据显示在图中（n = 3）。(N) ATP产生水平被测量并显示在图中（n = 3）。数据以平均值 ± SEM表示，通过Student’s t检验进行统计显著性分析（C, E, G, H, J, K, M, N）。****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.Arq/B nb-L 的构建及性能评价。(A) 仿生代谢免疫调节剂 (arg/B L) 逆转T细胞衰竭并增强放射免疫治疗的示意图。(B) 细菌膜上PD-L1纳米抗体表达的蛋白质印迹分析。(C) arg/B nb-L 的荧光光谱。(D) arg/B nb-L 的透射电子显微镜（TEM）图像。(E) arg/B nb-L 的ζ电位及动态光散射（DLS）分析。

Arg/B nb-L 通过输送 L-精氨酸并阻断 PD-L1 逆转 T 细胞耗竭。(A) rPD-L1nb 介导预防 T 细胞耗竭的示意图。(B) 使用免疫荧光染色评估 CT26 细胞在 B-L 或 B nb-L 处理下的 PD-L1 表达。PD-L1（绿色）和 DAPI（蓝色）。(C) 通过 αPD-L1 染色的平均荧光强度（MFI）定量分析 B-L 或 B nb-L 处理的 CT26 细胞的 PD-L1 表达。(D) 流式细胞术分析 CD8+ T 细胞上的 PD-1 表达（n = 3）。(E) (D) 中细胞比例的量化结果显示在图中（n = 3）。(F) 测量并在图中显示 ATP 产生水平（n = 3）。(G,H) 分析 Ctrl (G1)、-arg (G2) 和 arg-L (G3) 组中 PD-1+ 自由 L T ex 细胞比例的流式细胞术结果（n = 3）。(J) 测量并在图中显示 Ctrl 和自由 arg-L 组 T 细胞的 ATP 产生水平（n = 3）。(K,L) 分析 Ctrl (G1)、6 Gy (G2) 和 6 Gy arg/B nb-L (G3) 组中 PD-1+ CD8+ T ex、L-arg 和 nb 细胞比例的流式细胞术结果（n = 3）。(M) 测量并在图中显示 Ctrl (G1)、6 Gy 放疗处理 (G2) 和 6 Gy arg/B-L 处理 (G3) 组 T 细胞的 ATP 产生水平（n = 3）。数据以均值 ± SEM 表示；通过 Student t 检验确定统计学显著性 (C)。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）随后进行 Tukey 多重比较检验确定统计学显著性 (E, F, H, J, L, M)。****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05。

arg/B nb-L 介导的放射免疫治疗抑制肿瘤复发和转移。(A) CT26 复发性肿瘤模型示意图。(B) 接受不同治疗的 BALB/c 小鼠中 CT26 细胞的肿瘤体积（G1：对照；G2：6 Gy arg/B nb-L）（n = 5）。(C) 复发肿瘤小鼠的 Kaplan−Meier 生存曲线（n = 5）。(D) 肿瘤组织中 CD8 T 细胞记忆亚群的流式细胞术分析。(E) B16−F10 肺转移模型示意图。(F) 不同治疗组小鼠的体重变化（n = 5）。(G) 肺转移小鼠的 Kaplan−Meier 生存曲线（n = 5）。(H) 不同治疗组肺组织的代表性图像（G1：对照；G2：6 Gy；G3：6 Gy arg/B nb-L）。(I) 不同治疗组肺切片的 H&E 染色。(J) 肺肿瘤结节的定量（n = 5）。数据以均值 ± SEM 表示；统计学显著性通过单因素 ANOVA，随后进行 Tukey 多重比较检验确定（J）。****p < 0.0001。

总结

放疗在杀伤肿瘤的同时，也会给肿瘤微环境带来一些意想不到的变化。这项研究通过单细胞测序发现，X射线照射后会同时引发两个问题：肿瘤内的精氨酸代谢出现紊乱，同时PD-L1表达明显上调。这两个因素共同作用，抑制了CD8+ T细胞的能量代谢，导致PD-1+TIM-3+的耗竭T细胞大量扩增，最终削弱了放疗本应激活的抗肿瘤免疫。

针对这一机制，研究人员设计了一款仿生杂交纳米平台（arg/Bnb-L）。他们先将BL-21细菌改造成在膜表面展示PD-L1纳米抗体，再提取细菌膜与负载精氨酸的脂质体融合。这个组合既能通过纳米抗体精准阻断PD-1/PD-L1通路，又能给T细胞补充急需的精氨酸，从代谢层面恢复其战斗力。在小鼠肾癌和结肠癌模型中，arg/Bnb-L联合放疗显著增强了CD8+ T细胞的肿瘤浸润，同时大幅降低了耗竭T细胞的比例。更令人惊喜的是，这一策略还能有效抑制肿瘤复发和肺转移，部分小鼠实现了长期存活。

参考文献：DOI: 10.1021/acsnano.6c00839