ACS Nano | 指纹荧光原位杂交使病原细菌的多重鉴定成为可能

荧光原位杂交（FISH）是一种高度特异的致病细菌检测技术，无需培养，同时提供致病细菌的丰度、形态和空间定位信息。然而，传统 FISH 灵敏度有限且多路复用能力较差，阻碍了其更广泛的应用。本文提出了一种基于 DNA 自组装的指纹 FISH（FinFISH）策略，用于多重致病细菌检测。FinFISH 以呼吸道病原体为代表模型，采用三种不同的荧光团进行组合标记，为每种物种生成可识别的荧光指纹。在这项工作中，FAM、Cy3 和 Cy5 被选为荧光报告器，因为它们代表了多色成像和组合编码中成熟的荧光团组合，在标准荧光显微镜条件下光谱重叠极小。该策略使病原体检测远超荧光通道数量的限制，有效克服传统成像系统的通量瓶颈，同时具备高度可扩展性以实现进一步扩展。此外，定制设计的封闭芯片配备多通道反应室，提升了并行样品处理，简化了实验操作。实验结果表明，FinFISH 不仅在模拟痰液和尿液样本中识别致病细菌表现良好，还适用于临床样本。此外，FinFISH 还提供了关于混合感染的额外半定量见解。 随着未来扩展探针设计和人工智能（AI）辅助分析的整合，FinFISH 有望推动临床致病细菌诊断、微生物共定位研究以及肿瘤内细菌的空间分析。

该研究以题为“Fingerprinting Fluorescent In Situ Hybridization Enables Multiplexed Identification of Pathogenic Bacteria”发表在ACS Nano上。

病原细菌鉴定的FinFISH示意图。(a) FinFISH的整体设计原理。特异性靶探针与细菌rRNA杂交，暴露出一个引发链，从而触发杂交链反应（HCR），实现信号放大和指纹生成。(b) 通过调控H1和H2探针上荧光基团FAM、Cy3和Cy5的组合来设计FinFISH的原理。(c) 针对六种病原细菌设计的特异探针系统及其相应的荧光指纹方案，不同的荧光组合确保在荧光成像中识别每种病原细菌。

FinFISH的验证。(a) 荧光编码HCR组装示意图。固定在磁珠上的引发链触发HCR扩增。比例尺：5 μm。(b) FinFISH的正交性验证。引发子-探针配对验证的示意图。(c) 各引发子-探针组正交性验证结果的荧光成像。比例尺：5 μm。(d) 标记有不同引发子的磁珠与所有杂交探针反应的成像结果。比例尺：5 μm。(e) 混合磁珠与所有探针反应的荧光成像。比例尺：5 μm。

多细菌分析中FinFISH的可行性和性能验证。(a) 用于细菌分析的FinFISH示意图。(b) 使用通用探针和不同发夹探针的荧光成像。比例尺：5 μm。(c) 传统FISH与FinFISH的荧光信号比较分析。比例尺：5 μm。(d) FinFISH在大肠杆菌模型中的可及性评估。比例尺：5 μm。(e) 物种特异性探针设计工作流程。(f) 跨细菌种类和探针集的正交检测结果。比例尺：5 μm。(g) FinFISH在包含六种细菌的混合环境中的特异性。比例尺：5 μm。

总结

指纹荧光原位杂交技术（FinFISH）通过DNA自组装机制，为病原菌检测提供了一种全新的多重识别方案。研究人员以呼吸道病原菌为模型，巧妙地将FAM、Cy3和Cy5三种荧光染料组合标记到探针上，为每种细菌赋予独特的“荧光指纹”。当特异性探针与细菌rRNA结合后，会触发杂交链式反应，不仅实现了信号放大，还同时生成了可区分的荧光编码。借助自研的多通道封闭芯片，这一方法能够一次性并行处理多个样本，有效避免了传统开放操作中液体分布不均和人为误差的问题。

在模拟痰液、尿液以及真实临床样本的验证中，FinFISH表现出色。与传统FISH相比，它的灵敏度提升了十倍，检测限达到10³ CFU/mL，能在同一视野下精准区分六种混合感染的病原菌，甚至提供半定量的比例分析。临床样本测试中，FinFISH不仅准确识别出主要病原菌肺炎克雷伯菌，还同时检出了铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等低丰度菌群，展现了捕捉混合感染全貌的能力。这项技术为复杂感染场景下的快速诊断打开了新思路。

参考文献：

DOI: 10.1021/acsnano.5c18844