Advanced Materials|戳穿多能性：纳米注射至人类 iPSC 中

文章来源：北科纳米专业的纳米材料合成专家浏览次数：25时间：2026-04-01 设计合成：18101240246

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）在再生医学和疾病建模中发挥着关键作用，但其效用关键在于高效且安全地传递外源遗传物质。传统的病毒和电穿孔方法仍存在局限性，尤其是生物安全和监管障碍、转染精度不佳以及转染后细胞毒性较高。本研究首次将纳米管（NT）介导的纳米注射作为一种有效的非病毒策略，用于功能性信使 RNA（mRNA）向高多能干细胞（hiPSCs）递送。为实现向高多能干细胞（hiPSCs）的纳米注射，该研究实施了延迟细胞外基质（ECM）应用和先进的表面工程，结合重新设计的 NT 设计，采用大型货物储量以提升载荷能力和锐利的边缘几何形状，以改善细胞界面。通过 mCherry、GFP 和 YPet mRNA（平均转染率：约 55%至约 64%），在保持其多能性特征的同时，有效向高多能干细胞注入纳米，包括 mCherry 和 GFP mRNA 的共转染（约 61%）。通过多段传代的优异多能性标记表达（NANOG、OCT4、SOX2）和神经元分化能力，确认了纳米注射后 hiPSC 的完整性。这项概念验证性研究证明，纳米注射是将 mRNA 输送到高表达率高多能干细胞的强大工具，并确立了纳米注射作为精确细胞工程和功能干细胞应用的平台。

该研究以题为“Poking Pluripotency: Nanoinjection Into Human iPSCs”发表在Advanced Materials上。图1

NT介导的mRNA递送至人诱导多能干细胞的工作流程。简要而言，将hiPSC与负载mRNA的NT相互作用，并于次日分析报告蛋白（mCherry、GFP、YPet）的表达情况。a-i) 通过紫外/臭氧进行表面活化。a-ii) 使用聚-D-赖氨酸（分子量：1–5 kDa）进行表面功能化。a-iii) NT负载mRNA（85 ng/µL）。a-iv) 移除负载货物的上清液。b-i) 使用20 µM Y-27632对hiPSC进行ROCK抑制剂预处理。b-ii) 使用Accutase解离hiPSC集落。c-i) 将hiPSC接种至NT阵列（单细胞）。c-ii) 将细胞离心至NT上（220 g，15分钟）。c-iii) 从负载mRNA的NT中进行货物摄取。c-iv) 原位包被细胞外基质（Matrigel）。c-v) 使用共聚焦显微镜成像和流式细胞术分析表达情况（报告蛋白）。本图部分使用biorender.com创建。

图2

NT阵列芯片设计、NT几何结构与货物负载。a) 用于深反应离子刻蚀工艺的硅片，表面带有4×4图案阵列。插图：仅含NT的4×4 mm²硅片，用于转染实验。b) NT阵列的扫描电子显微镜图像（展示阵列排布及NT尺寸）。阵列间距为3 µm，NT长度约为3.2 µm（大范围概览见图S6）。c) NT尖端特写图像。NT直径约为1 µm，尖端边缘厚度小于50 nm。d) 负载荧光标记mRNA（Cy5标记的mRNA）后NT的共聚焦显微镜图像（俯视图）。从整体视图可见清晰的NT图案（点状），NT发出的稳定Cy5信号表明整个NT阵列负载均匀（亮度定量分析见图S9）。

图3

hiPSC与NT阵列相互作用后的扫描电镜与共聚焦显微镜成像。a) 在NT阵列上培养的hiPSC的整体SEM图像（其他示例见图S18）。b) 单个细胞的放大特写视图（从图a中放大）。c) 在NT上过夜培养后hiPSC的活死染色（活细胞经Calcein染色，绿色；死细胞经碘化丙啶染色，红色）。Hoechst 33342细胞核复染及平面对照组见图S19a。d) 根据PI通道统计的在平面/空白、平面/mRNA和NTs/mRNA上培养的hiPSC细胞活力（基于Calcein的细胞活力数据见图S19b）。e) 负载mCherry-mRNA的NT上hiPSC在收获前及表达mCherry时的共聚焦显微镜图像，mCherry呈红色（细胞经Calcein染色，呈绿色/灰色）。插图：细胞质中可见暗点图案构成的NT阵列，表明细胞膜形成了压痕（焦平面位于NT尖端）。mCherry成像时的焦平面位于细胞中心（远离NT处）。其他示例见图S20。采用ANOVA分析及事后Tukey检验，n.s.：无显著性差异，n = 3。

总结

这项研究首次将纳米注射技术成功应用于人诱导多能干细胞（hiPSC），并实现了高效、低毒性的mRNA递送。研究团队设计了一种新型纳米管阵列芯片，其独特之处在于纳米管带有大容量的储库和厚度小于50纳米的锋利边缘——储库容积和表面积远超以往设计，大大提升了mRNA的装载能力。更重要的是，研究人员根据hiPSC的特殊培养需求对操作流程做了关键调整：采用低分子量聚-D-赖氨酸进行表面修饰，恰到好处地平衡了mRNA的吸附与释放；将细胞外基质的涂覆延迟到细胞与纳米管接触之后，避免了基质蛋白对递送过程的干扰；配合ROCK抑制剂预处理和即时离心，让细胞与纳米管形成紧密贴合。这套定制化的“细胞友好型”流程，最终让纳米注射在hiPSC上得以实现。

实验结果显示，通过这种纳米管阵列递送mCherry、GFP、YPet等多种报告基因mRNA，转染效率稳定在55%至64%之间，共转染两种不同mRNA的效率也达到了61%——相比之下，平面芯片对照组仅不足10%。更重要的是，经过纳米注射的hiPSC依然保持约75%的存活率，细胞在收获后能重新形成致密集落，连续传代三周后仍稳定表达NANOG、OCT4、SOX2等多能性标志物，并且能够正常分化为MAP2阳性的神经元。这意味着这种物理递送方式在高效转染的同时，几乎没有损伤细胞的核心功能，为今后利用hiPSC进行基因编辑、疾病建模或再生医学研究提供了一种温和而强大的工具。

参考文献：

DOI: 10.1002/adma.202521046

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