Journal of Nanobiotechnology| 具有增强酶拟活性的膜涂层普鲁士蓝纳米复合体通过减少骨前驱细胞衰老和巨噬细胞炎症，缓解老年性骨质疏松

老年性骨质疏松（SOP）是一种慢性与年龄相关的骨骼疾病，表现为骨质逐渐流失和高骨折风险，其发病机制与过高活性氧（ROS）、骨前体细胞衰老和巨噬细胞炎症有关。普鲁士蓝（PB）纳米酶在 SOP 中具有抗氧化潜力，但受限于靶向不良、循环时间短和机制不明，限制了临床转化。本研究中，我们制造了巨噬细胞膜伪装的柠檬酸盐修饰 PB（M@CPB）纳米酶，用于靶向 SOP 治疗，并阐明了其背后机制。巨噬细胞膜涂层使 M@CPB 的血液半衰期延长了 1.47 倍，骨组织积累量则比 CPB 延长了 3.09 倍。体外，M@CPB 抑制 O₂⁻42.17%，清除 H2O2222.38%，降低骨前驱细胞衰老，促进 M1 至 M2 巨噬细胞极化，并将核因子κB 配体受体激活因子（RANKL）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌比例分别降低至模型组的 47.41%和 53.10%。体内 M@CPB 骨体积与组织体积比 SOP 小鼠增加 3.83 倍，有效缓解骨流失、运动功能障碍和抑郁样行为。M@CPB 整体通过介入 ROS 衰老-炎症轴和平衡骨骼重塑，缓解了 SOP 的侵蚀，为 SOP 及潜在的其他年龄相关疾病提供了创新的治疗策略。

该研究以题为“Membrane-coated Prussian blue nanocomplex with enhanced enzyme-mimic activity alleviates senile osteoporosis by reducing osteoprogenitor cell senescence and macrophage inflammation.”发表在Journal of Nanobiotechnology上。

图1

M@CPB的制备及其治疗老年性骨质疏松策略的示意图（使用Figdraw.com创建；许可号TWRYAb891b）。(A) 通过RAW264.7膜提取、CPB纳米颗粒合成以及搅拌和离心包膜制备M@CPB。(B) M@CPB通过调控破骨细胞生成和成骨，恢复骨稳态，对老年性骨质疏松的治疗效果。(C) 通过缓解线粒体功能障碍和减少ROS发挥抗氧化作用。(D) 通过调节p16/p21表达和解除细胞周期阻滞发挥抗衰老作用，减轻骨祖细胞衰老并恢复功能。(E) 通过巨噬细胞从M1向M2极化及调节TNF-α、IL-6和IL-10发挥抗炎作用。

图2

M@CPB的制备与表征。(A, B) CPB和M@CPB的TEM图像。(C) CPB和M@CPB的粒径、Zeta电位和PDI。(D) M@CPB在超纯水中的14天稳定性。(E) MΦm和M@CPB中膜蛋白的SDS-PAGE分析。(F) MΦm和M@CPB中特征膜蛋白的蛋白质印迹分析。(G) 与CPB、Lip@CPB、MΦm和M@CPB孵育后上清中残留RANKL水平（初始浓度：200 pg/mL）。(H) 与CPB、Lip@CPB、MΦm和M@CPB孵育后上清中残留TNF-α水平（初始浓度：500 pg/mL）。(I) M@CPB的SOD模拟活性示意图。(J) 不同浓度CPB的O₂⁻清除活性。(K) CPB、MΦm和M@CPB清除O₂⁻的代表性吸收光谱。(L) CPB、MΦm和M@CPB的O₂⁻抑制率定量。(M) M@CPB的CAT模拟活性示意图。(N) 重复加入H₂O₂后CPB、MΦm和M@CPB的催化性能。(O) 不同样品在0和120分钟时产生氧气泡的代表性图像。(P) CPB、MΦm和M@CPB在10分钟内的H₂O₂分解率。(Q) M@CPB的POD模拟活性示意图。(R) CPB、MΦm和M@CPB组中氧化TMB的吸光度。(S) 10分钟内氧化TMB的时间依赖性吸光度变化。(T) M@CPB在不同H₂O₂浓度下的Michaelis-Menten曲线。(U) M@CPB通过酶模拟活性清除ROS的示意图（使用Figdraw.com创建；许可号ATYURfe6fe）。所有定量数据以均值±SD表示（n=3）。

图3

炎症趋向性和免疫逃逸特性促进M@CPB在骨质疏松病灶中的蓄积。(A) SOP小鼠静脉注射CPBCe6或M@CPBCe6后2小时的体内荧光成像。(B, C) 注射后36小时骨骼和主要器官（心、肝、脾、肺、肾和脑）的离体荧光成像。(D) 骨骼（上肢、下肢、腰椎）和主要器官（心、肝、脾、肺、肾、脑）的荧光强度。(E) 骨-器官靶向指数。(F) 静脉注射CPBCe6或M@CPBCe6后24小时内不同时间点采集的血浆样本荧光图像。(G) CPBCe6和M@CPBCe6的药代动力学特征和循环半衰期。(H) Transwell实验示意图（使用Figdraw.com创建；许可号YUUUT435d8）。(I) 纳米颗粒跨内皮转运的定量。(J) 不同条件下MC3T3-E1和RAW264.7细胞对M@CPBCe6、CCR2i-M@CPBCe6和Lip@CPBCe6的细胞摄取。(K) 静息RAW264.7细胞对CPBCe6、Lip@CPBCe6和M@CPBCe6的时间依赖性摄取。所有定量数据以均值±SD表示（n=3）。

图4M@CPB减轻MC3T3-E1细胞中的氧化应激并改善线粒体功能障碍。(A) 不同浓度H₂O₂处理后MC3T3-E1细胞的细胞活力。(B) M@CPB存在下不同浓度H₂O₂处理的MC3T3-E1细胞的细胞活力。(C) 不同浓度H₂O₂处理的Calcein-AM/PI染色MC3T3-E1细胞的代表性共聚焦图像。(D) M@CPB存在下不同浓度H₂O₂处理的Calcein-AM/PI染色MC3T3-E1细胞的代表性共聚焦图像。(E, F) 使用DCFH-DA探针的流式细胞术分析及MC3T3-E1细胞内ROS的定量。(G) 使用DCFH-DA探针检测的MC3T3-E1细胞内ROS代表性共聚焦图像。(H) MC3T3-E1细胞中细胞内ATP水平。(I, J) JC-1染色评估MC3T3-E1细胞线粒体膜电位的代表性共聚焦图像及定量。(K) 显示MC3T3-E1细胞线粒体形态的代表性TEM图像。所有定量数据以均值±SD表示（n=3）。

图5

M@CPB逆转MC3T3-E1细胞衰老并促进成骨分化。(A) M@CPB介导MC3T3-E1细胞衰老逆转的示意图（使用Figdraw.com创建；许可号AWYPTa2aa4）。(B) 不同处理后MC3T3-E1细胞的代表性β-gal染色图像。(C) 不同处理后MC3T3-E1细胞中γ-H2AX的代表性共聚焦图像。(D) 不同处理后MC3T3-E1细胞中p16INK4a的代表性共聚焦图像。(E) 不同处理后MC3T3-E1细胞中p21的代表性共聚焦图像。(F–I) 不同处理后MC3T3-E1细胞的流式细胞术细胞周期分析及细胞周期分布、G1期比例和G2期比例的定量。(J) 不同处理后MC3T3-E1细胞中ALP活性的定量。(K, L) 通过ALP和ARS染色评估不同处理后MC3T3-E1细胞的成骨分化。所有定量数据以均值±SD表示（n=3）。

总结

老年性骨质疏松与活性氧堆积、骨前体细胞衰老和巨噬细胞炎症相关，普鲁士蓝纳米酶虽具抗氧化潜力，但靶向差、循环短。我们制备了巨噬细胞膜伪装的柠檬酸盐修饰普鲁士蓝纳米酶，膜涂层使血液半衰期延长1.47倍，骨组织蓄积提高3.09倍。体外该纳米酶清除超氧阴离子和过氧化氢，减少骨前体细胞衰老，促进巨噬细胞M1向M2极化，并降低RANKL和TNF-α分泌。体内显著增加骨体积比，缓解骨流失及运动与情绪障碍，机制上干预活性氧-衰老-炎症轴并平衡骨重塑。

该工作将纳米酶的催化活性与细胞膜仿生靶向结合，解决了普鲁士蓝在骨组织递送效率低的问题，并明确了其通过衰老-炎症轴发挥作用的机制。未来可优化膜来源或表面修饰，提升对不同骨部位的靶向精度。该策略可拓展至其他与氧化应激和细胞衰老相关的骨病，如糖皮质激素性骨质疏松或骨折延迟愈合。普鲁士蓝的成像特性有助于追踪体内分布。长期蓄积和重复给药的安全性需进一步评估，但该仿生设计为年龄相关骨病提供了可转化的治疗思路。

参考文献：

DOI:10.1186/s12951-026-04771-x

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