焦虑在临床上与骨折愈合受损相关，但其潜在免疫机制尚不明确，且目前尚无靶向治疗。在一个慢性约束压力（CRS）引起焦虑伴股骨骨折的小鼠模型中，我们观察到骨髓中TGFβ1CCR5双阳性中性粒细胞的扩张。这些中性粒细胞通过TGFβ1分泌抑制骨髓间充质干细胞（BMSC）的骨源分化，而BMSC衍生的CCL5则相互促进中性粒细胞活化，形成破坏骨折修复的有害反馈。在机制上，CRS激活了NF-κB–CCR5轴，以上调CCR5并维持这一中性粒细胞亚组。我们发现乙酰-11-酮β-博斯韦尔酸（AKBA）直接结合YAP1，缓解了YAP1介导的泛素特异性肽酶31（USP31）抑制，从而抑制NF-κB磷酸化和CCR5表达，减少致病性中性粒细胞群体并恢复BMSCs的骨源功能。为克服AKBA溶解度差、生物利用度低及组织非选择性等问题，我们开发了NIMP-R14适配体修饰表食饭堂娘子酸（EGCG）涂层纳米载体（AKBA@E-N），该载体能增强中性粒细胞在断裂部位酸性微环境中的局部吸收和保留。在体内，AKBA@E-N显著加速了骨折愈合，相较游离AKBA。本研究揭示了中性粒细胞介导的机制，将压力与骨骼修复障碍联系起来，并提供了一种针对性的抗热治疗策略。

该研究以题为“Aptamer-functionalized EGCG nanocarrier for neutrophil-targeted AKBA delivery promotes anxiety-related fracture healing”发表在Bioactive Materials 上。

图1

焦虑相关骨折延迟愈合的机制与治疗。在焦虑伴骨折的小鼠模型中，CRS激活中性粒细胞中的YAP1–USP31–NF-κB–CCR5信号轴，导致TGFβ1CCR5双阳性中性粒细胞异常积累和TGFβ1分泌过多。TGFβ1抑制TRAF3表达，激活BMSC中的NF-κB–CCL5通路，形成正反馈回路，扰乱骨骼稳态并延迟骨折愈合。本研究构建的AKBA@E-N递送系统以EGCG为载体，载入AKBA，并用NIMP-R14适体修饰其上，该适体可在断裂部位的酸性微环境中释放，实现局部保留并增强中性粒细胞吸收。通过抑制上述信号轴，AKBA可以逆转愈合障碍并促进骨骼修复。

图2

CRS延缓骨折愈合，并增加小鼠中TGFβ1CCR5双阳性中性粒细胞的比例。++（A）骨折后第0、7、14和21天对对照组和直肠直肠管线组的X光影像。n = 6。（B）微型CT三维骨折端重建图像，以及小鼠BV/TV和BMD的定量分析。n = 6。（C）Col1a1、Bglap和Runx2的mRNA水平。n = 3。（D）CCR5、TGFβ1及骨源标志物（COL1A1、OCN、RUNX2）的蛋白表达水平。n = 3。（E）小鼠原级中性粒细胞分离和提取工作流程的示意图。（F）通过流式细胞术鉴定原级中性粒细胞的表型鉴定和纯度验证。（G）通过激光共聚焦显微镜下的免疫荧光染色对原级中性粒细胞进行形态学观察。比例杆：5微米。（H）通过激光共聚焦显微镜免疫荧光捕捉的TGFβ1CCR5双阳性中性粒细胞的形态学及亚细胞定位。比例杆：5微米。（I） TGFβ1CCR5双阳性细胞免疫荧光染色的代表性图像，比例条：25微米。n = 3。（J） 流式细胞术显示双阳性细胞的比例。n = 3。（K）免疫荧光图像显示对照组和焦虑性骨折组骨痂处的TGFβ1CCR5双阳性细胞。比例尺：200微米，40微米。

图3

TGFβ1CCR5中性粒细胞抑制BMSCs在共培养中的骨发生性分化。++（A）TGFβ1CCR5双阳性中性粒细胞MACS示意图。（B）对分选中性粒细胞中TGFβ1和CCR5表达进行免疫荧光染色。比例杆：5微米。（C）通过流式细胞术确定了分选的双阳性细胞比例。（D）Transwell共培养系统的示意图，该系统由TGFβ1CCR5中性粒细胞和BMSCs组成。（E）在共培养中骨生成诱导7天后，对BMSCs阳性区域进行ALP染色及定量分析。n = 3。（F）在共培养中骨生成诱导14天后，对BMSCs正性区域进行阿利扎林红染色及定量分析。n = 3。（G）共培养后BMSCs中Col1a1、Bglap、Runx2的mRNA水平。n = 3。（H） 共培养后BMSCs中COL1A1、OCN和RUNX2的蛋白质水平。n = 3。

图4

AKBA抑制TGFβ1CCR5中性粒细胞的比例，并抑制BMSC的骨生成分化。++（A）AKBA的化学结构。（B） 在梯度浓度下进行24小时AKBA处理后，CCK-8中性粒细胞活性的测定。（C）AKBA治疗后0、6和12小时的活/死染色。（D）AKBA干预后对TGFβ1CCR5双阳性中性粒细胞进行免疫荧光染色和定量。（E）通过流式细胞术分析了AKBA处理后中性粒细胞中TGFβ1和CCR5的表达水平。（F）与AKBA处理中性粒细胞共培养的BMSCs中，Col1a1、Bglap和Runx2的mRNA水平。（G）共培养系统中BMSCs中COL1A1、OCN和RUNX2的蛋白质水平。（H） 在共培养中7天后对BMSCs进行ALP染色及定量分析。（I）共培养14天后，BMSCs出现阿利扎林红色染色。n = 3。

图5

AKBA通过调控NF-κB-CCR5轴并靶向中性粒细胞中的YAP1发挥作用。（A）中性粒细胞转录组测序的火山图。（B）KEGG通路富集分析。（C）调控CCR5表达的关键基因和通路的弦图分析。（D）对照组、CRS组和CRS + AKBA组中NF-κB-CCR5轴相关分子的mRNA水平。n = 3。（E）对照组、CRS组和CRS + AKBA组中NF-κB-CCR5轴相关分子的蛋白质水平。n = 3。（F）免疫荧光染色显示AKBA处理能减弱中性粒细胞中的NF-κB核易位。n = 3。（G） 利用Autodock Vina对AKBA与YAP1之间的结合模式、关键相互作用残基及结合自由能进行分子对接分析。（H） 通过共聚焦激光显微镜观察到FITC-AKBA和YAP1在细胞内的共定位。（一）通过药物亲和力响应靶点稳定性测定（DARTS）确认AKBA与YAP1结合。（J）Hoxb8细胞中的生物素拉低检测确认了生物素-AKBA结合的YAP1直接结合，但未与YAP1-R89A突变体结合。（K） 通过细胞热移分析评估了 AKBA 处理后 YAP1 和 YAP1-R89A 的热稳定性。

总结

焦虑常让骨折更难愈合，但免疫机制和靶点一直不清楚。作者用慢性约束压力诱导焦虑并合并股骨骨折的小鼠，发现骨髓中TGFβ1、CCR5双阳性中性粒细胞扩增。它们分泌TGFβ1，抑制骨髓间充质干细胞成骨分化；BMSC产生的CCL5又反过来激活中性粒细胞，形成有害反馈，破坏修复。机制上，CRS激活NF-κB–CCR5轴，上调CCR5并维持该亚群。整体思路是沿压力—中性粒细胞—BMSC—骨修复这条链找关键节点。

AKBA直接结合YAP1，解除YAP1对USP31的抑制，压低NF-κB磷酸化和CCR5表达，减少致病中性粒细胞，恢复BMSC成骨。可AKBA溶解度差、生物利用度低、组织选择性弱，于是做成NIMP-R14适配体修饰、EGCG涂层的纳米载体AKBA@E-N，使其在骨折部位酸性微环境中更多被中性粒细胞吸收并滞留。体内AKBA@E-N比游离AKBA更明显加速骨折愈合。这为压力相关骨修复障碍提供了靶向免疫治疗思路。

参考文献：

DOI:10.1016/j.bioactmat.2026.09.028

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