纳米酶材料设计——Cell |穿孔素触发铁诱导的线粒体损伤，从而驱动铁死亡和抗肿瘤免疫

该研究以题为“Perforin triggers iron-induced mitochondrial damage to drive ferroptosis and anti-tumor immunity”发表在Cell上。

      细胞毒性CD8 T细胞和自然杀伤细胞是抗肿瘤免疫的关键效应细胞。细胞毒性淋巴细胞通过释放穿孔素（Prf1）来清除肿瘤细胞，穿孔素是一种形成孔道的蛋白质，能使颗粒酶（Gzms）进入靶细胞，从而触发依赖和不依赖半胱天冬酶的细胞死亡。在此，我们发现穿孔素一种先前未被认识的、不依赖颗粒酶的功能。我们发现穿孔素可直接诱导肿瘤铁死亡，这是一种依赖铁和脂质的细胞死亡形式。从机制上讲，穿孔素介导的孔道形成驱动转铁蛋白受体的内吞作用，从而增加细胞铁摄取。穿孔素促进内体-线粒体接触的形成，这导致线粒体铁积累、线粒体功能障碍和肿瘤细胞铁死亡。在小鼠肿瘤模型中，饮食补铁以穿孔素依赖的方式抑制肿瘤进展。临床癌症患者中，穿孔素表达水平较高与生存率提高和对免疫检查点阻断治疗反应增强相关。这些发现定义了穿孔素通过铁死亡直接执行癌细胞死亡的一种不依赖颗粒酶的功能。

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图1

（A）来自结直肠癌（CRC）、黑色素瘤、三阴性乳腺癌（TNBC）以及非小细胞肺癌（NSCLC）的人源单细胞测序数据中，表达穿孔素但不表达颗粒酶（Gzm）A/B的T细胞与NK细胞占比。（B）MC38、YUMM5.2、B16F10-OVA以及原位结直肠癌类器官模型中T细胞与NK细胞占比。（C）泛癌患者RNA测序样本按照穿孔素表达量分为高表达组与低表达组，随后比较两组生存期。样本量n = 7489。（D、E）混合肿瘤队列依据穿孔素表达分组，分析接受抗PD-1（n = 520）、抗PD-L1（n = 486）或抗CTLA-4（n = 121）治疗后的无病生存期。（F）具有统计学差异的ICB Atlas21汇总测序数据中，免疫检查点阻断（ICB）应答者与无应答者的穿孔素平均表达水平。（G）依据穿孔素与颗粒酶B的表达比值分组，分析接受免疫检查点阻断治疗的黑色素瘤患者总生存期。样本量n = 109。（H）非小细胞肺癌患者的单细胞测序数据经伪批量处理，划分为CD8⁺T细胞和NK细胞，计算穿孔素与颗粒酶A或B的表达比值，并评估病理完全缓解（pCR）、主要病理缓解（MPR）以及非主要病理缓解（non-MPR）情况。样本量n = 221。（I）将HT1080和HCT116细胞分别与野生型（WT）、GzmB⁻/⁻或Prf1⁻/⁻人YT-INDY NK细胞共培养4小时，随后用碘化丙啶染色并通过流式细胞术检测。（J、K）HT1080和MC38细胞先用1 μM颗粒酶B抑制剂I预处理16小时，再与NK细胞共培养4小时或与T细胞共培养24小时，之后用碘化丙啶染色并通过流式细胞术检测。（L）NK细胞先用250 μM 3,4-二氯异香豆素预处理30分钟，或用5 μM ZVAD-FMK预处理30分钟，再与指定肿瘤细胞系共培养4小时。（M）MC38细胞先用250 μM 3,4-二氯异香豆素预处理30分钟，再与T细胞共培养24小时，随后用碘化丙啶染色并通过流式细胞术检测。（N）MC38-OVA细胞使用指定细胞死亡抑制剂预处理16小时。从脾脏分离OT-I细胞，以1:32的比例共培养。（O）腹腔注射100000个MC38细胞以诱导NK细胞募集。72小时后收集腹腔NK细胞，共培养24小时后检测细胞杀伤活性。（P–S）将MC38（P）、YUMM5.2（Q）、MCA-205（R）以及LLC（S）细胞接种至野生型C57/BL6、GzmA/B⁻/⁻或Prf1⁻/⁻小鼠两侧胁腹部。使用游标卡尺测量肿瘤体积，实验终点记录肿瘤重量。P组n = 6–9只，Q组n = 7只，R组n = 5–6只，S组n = 6–7只小鼠。（T）将YUMM5.2肿瘤皮下接种至Prf1⁻/⁻小鼠。第0天以及之后每7天腹腔注射100 μg抗NK1.1抗体或抗CD8抗体。n = 5–6只小鼠。采用单因素方差分析或t检验评估统计学差异。∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。体外实验数据以均值±标准误表示。展示数据为至少三次独立生物学重复、结果稳定的代表性实验；统计检验基于该代表性实验内的技术重复。

图2

（A）HT1080细胞与HCT116细胞先用焦亡素D抑制剂LDC7559（20 μM）、坏死抑素-2（10 μM）或ZVAD-FMK（5 μM）预处理16小时，之后联合穿孔素与细胞死亡抑制剂共同处理。4小时后检测细胞死亡情况。对照组未标注显著性差异。（B）HT1080细胞与HCT116细胞先用利普罗他汀（3 μM）、铁抑素（3 μM）、地拉罗司（50 μM）及去铁酮（50 μM）预处理16小时，再加入穿孔素共同处理。4小时后检测细胞死亡情况。（C）HT1080细胞与HCT116细胞经穿孔素处理4小时后，使用Cell Rox Green染色，检测平均荧光强度（MFI）。（D）将MC38细胞接种于野生型C57/BL6小鼠和Prf1⁻/⁻小鼠体内，实验终点处死小鼠。肿瘤组织经胶原酶消化后用Cell Rox Green染色，圈选肿瘤细胞群体，统计Cell Rox Green高阳性细胞占比并作图。（E）HT1080细胞经穿孔素处理4小时后，采用BODIPY C11染色，对氧化脂质占总脂质的比值进行标准化处理并绘图。（F）HT1080细胞经亚裂解浓度穿孔素处理4小时后，开展脂质组学检测。样本先按各类脂质总含量标准化，再以溶剂对照组为参照校正。（G）HCT116细胞经穿孔素处理4小时后，采用BODIPY C11染色，对氧化脂质占总脂质的比值进行标准化处理并绘图。（H）将MC38肿瘤细胞皮下接种至C57/BL6小鼠或Prf1⁻/⁻小鼠。实验终点取肿瘤组织进行4HNE染色，对图像进行分区分析，统计每个视野下阳性细胞数量并绘图；图为代表性图像，每组小鼠n=3–5只。（I、J）第0天向野生型小鼠与Prf⁻/⁻小鼠腹腔注射MC38细胞以激活NK细胞；第2天腹腔注射标记后的MC38细胞；第3天收集细胞，使用碘化丙啶与BODIPY C11染色，圈选CellTraceViolet阳性的肿瘤细胞进行分析。（K）结直肠癌患者数据集（GSE178341）中，穿孔素在T细胞与NK细胞高表达的患者，铁死亡基因特征（WikiPathway Ferroptosis，WP4313）富集上调，共纳入62例患者；依据穿孔素表达中位数分组，高表达组31例，低表达组31例。（L）HT1080细胞或HCT116细胞先用RSL3（0.25 μM）预处理16小时，再与穿孔素共孵育4小时；HT1080细胞或HCT116细胞先用IFN-γ（10 ng/mL）预处理16小时，再与穿孔素共孵育4小时，检测细胞死亡水平。（N）HT1080细胞先用IFN-γ（10 ng/mL）、铁抑素（10 μM）或利普罗他汀（10 μM）预处理16小时，再与穿孔素共孵育4小时，检测细胞死亡水平。（O）示意图：穿孔素与IFN-γ协同诱导肿瘤细胞发生铁死亡的潜在作用模式。统计学显著性采用单因素方差分析或t检验评估。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。体外实验数据以平均值±标准误表示；展示结果为至少三次独立生物学重复中结果一致的一次代表性实验，统计分析基于该次代表性实验内的技术重复。

图3

(A) 用穿孔素处理HT1080和HCT116细胞4小时后，进行FerroOrange染色，圈选活细胞，检测FerroOrange的平均荧光强度（MFI）。(B) 在4℃或37℃条件下用穿孔素处理HT1080和HCT116细胞4小时，随后进行FerroOrange染色，圈选活细胞，检测FerroOrange的平均荧光强度（MFI）。(C) 用野生型（WT）或TMH1突变型穿孔素处理HT1080和HCT116细胞4小时，之后检测细胞死亡情况。(D) 穿孔素杀伤作用的工作模型示意图。(E) 用德纳索雷（dynasore，5 μM）或甲基-β-环糊精（0.5 μM）预孵育HT1080和HCT116细胞16小时，再加入对应抑制剂与穿孔素共同处理4小时，随后检测细胞死亡情况。(F) 穿孔素处理HT1080或HCT116细胞4小时，不进行透膜处理，随后进行转铁蛋白受体（TFR）染色，采用流式细胞仪采集信号。(G) 将HT1080或HCT116细胞与NK细胞共培养，不进行透膜处理，使用人源转铁蛋白受体（TFR）抗体染色，通过流式细胞仪检测。(H) 穿孔素预处理HT1080或HCT116细胞4小时，再加入pHRhodo标记的转铁蛋白（TF）处理15分钟。(I) 使用含全铁转铁蛋白（holo-TF）的无血清培养基预孵育HT1080或HCT116细胞，再加入穿孔素与全铁转铁蛋白共同处理4小时，之后分析细胞死亡情况。(J、K) 使用DMT1阻断剂2（5 μM）或ferristatin II（50 μM）预孵育HT1080或HCT116细胞16小时，再加入穿孔素处理4小时，检测线粒体铁水平与细胞死亡情况。(L、M) 野生型HT1080细胞或DMT1敲除（DMT1−/−）HT1080细胞经ferristatin II（50 μM）预孵育16小时，再用穿孔素处理4小时，检测细胞死亡和线粒体铁水平。(N) 野生型B16F10细胞或转铁蛋白受体敲除（TFR−/−）B16F10细胞经穿孔素处理4小时后检测细胞死亡。(O、P) 第0天向小鼠腹腔注射10万个野生型B16F10细胞；第2天腹腔注射500万个经CellTrace Violet标记的空载B16F10细胞或TFR−/− B16F10细胞；第3天收集腹腔灌洗液，标记细胞经碘化丙啶和MitoFerro Green染色。n=6只小鼠。采用单因素方差分析或t检验评估统计学差异。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。体外实验数据以平均值±标准误表示；展示结果为至少三次独立生物学重复中结果一致的一次代表性实验，统计学分析基于该代表性实验内的技术重复。

图4

（A–K）HCT116细胞经溶剂对照或穿孔素处理4小时。（A）对细胞进行TOM20（红色）、EEA1（粉色）和DAPI（蓝色）染色，采用Airyscan检测模式采集三维图像。箭头指示典型的环形线粒体。（B）利用Imaris软件对（A）中的图像进行自动渲染，并计算TOM20与EEA1结构之间的表面接触面（SCA）；TOM20-EEA1表面接触面积以灰色结构显示。每组条件统计20个细胞，定量分析TOM20、EEA1以及TOM20-EEA1表面接触面积对应的结构体积、总体积和结构数量。（C）该图为标准化后的TOM20-EEA1表面接触面积总和定量结果，以单个细胞线粒体总体积为参照进行归一化处理。（D、E）图分别统计单个细胞内线粒体TOM20结构的数量以及线粒体TOM20结构的总体积。（F）穿孔素处理后的HCT116细胞电镜图像。箭头标注异常内体以及线粒体-内体接触位点。（G–I）每组条件统计30个HCT116细胞，定量分析TF-内体结构的总体积、平均体积以及结构数量。（J）每组条件统计30个细胞，定量分析单个细胞内TMRM-TF表面接触面积结构的总体积。（K）通过时序成像分析活细胞内的内体-线粒体相互作用。穿孔素处理组细胞的TF总量从第一次时序成像至第三次时序成像呈上升趋势；溶剂对照组细胞的TF总量在该时间段内无显著变化。在第三次时序成像时间点，穿孔素处理组的TF总量显著高于溶剂对照组。每组条件分析9个细胞。（L）穿孔素诱导铁离子升高的机制示意图。（M）提取人结肠肿瘤组织RNA，制备cDNA后，针对肌动蛋白和穿孔素进行反转录PCR（RT-PCR）检测。细胞沉淀经硝酸消解、复溶后，送入质谱仪检测，并结合标准曲线完成分析。样本量n = 9。采用单因素方差分析或t检验评估统计学差异。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。体外实验数据以平均值±标准误表示。所示数据为至少三次独立生物学重复、结果一致的代表性实验；统计结果基于该代表性实验内的技术重复。

参考信息

Pub Date : 2026-10-23,

DOI:10.1016/j.cell.2026.09.062