基于核酸的基因疗法在精准治疗胰腺导管腺癌（PDAC）方面具有巨大潜力，但其临床转化仍面临诸多挑战，例如缺乏能够同时最大限度减少有效载荷泄漏、固有毒性和免疫原性的高效递送平台。本文报道了一种基于滚环复制的酸激活核酸纳米前药，该前药可直接整合大量扩增的Cas12/crRNA核糖核蛋白（RNP）和反义寡核苷酸（ASO），且仅需少量赋形剂，从而实现肿瘤特异性激活，用于PDAC联合基因治疗。该纳米前药由一条与Cas12a偶联的聚合物crRNA链（Pro-RNPs）和一条聚合物ASO链（Pro-ASOs）组装而成。后者包含用于靶向癌细胞的AS1411适体和用于刺激响应释放的HhaI酶切位点，同时其表面负载有酸可降解聚合物包覆的HhaI酶。当被胰腺导管腺癌（PDAC）细胞摄取后，纳米前药在酸性溶酶体内通过HhaI酶聚合物包覆的降解而被激活。HhaI酶切割特定的识别位点，而过表达的核糖核酸酶H则水解DNA-RNA异源双链体中的RNA链。这些联合切割事件破坏了纳米前药，从而能够高效地共释放ASO和Cas12a/crRNA RNP，实现精确的基因沉默和编辑。在患有 PDAC 的小鼠体内进行的研究表明，该药物具有强大的抗肿瘤活性，且全身毒性或免疫原性极低，为胰腺癌的精准基因治疗提供了一种有前景的策略。

该研究以题为“Acid‐Activatable Rolling Circle Replication‐Based Nucleic Acid Nano‐Prodrug for Combined Gene Therapy of Pancreatic Cancer”发表在Advanced Materials 上。

图1

Pro-GRAD用于PDAC联合基因治疗的示意图。(a) 通过RCT和RCA纳米技术对Pro-GRAD进行分子设计与构建。(b) Pro-GRAD在酸激活后的细胞摄取及联合基因治疗过程。

图2

Pro-RAD的合成与表征。(a) RCT产物的12% PAGE分析。(b) Cas12a蛋白负载率的SDS-PAGE分析。(c) Pro-RNPs的TEM图像。(d) DLS分析的Pro-RNPs流体力学直径分布。(e) RCA产物的12% PAGE分析。(f) RCA产生的超长DNA链（Pro-ASOs）的AFM图像。(g) Pro-ASOs和RCA模板反义链退火产物（RCA-template AS）的CD光谱。(h) Pro-RNPs和Pro-ASOs结合形成Pro-RAD的示意图。(i) Pro-RAD的TEM图像。(j) DLS分析的Pro-RAD流体力学直径分布。(k) Pro-RNPs和Pro-RAD的Zeta电位。数据以均值±SD表示，n=5。数据通过单因素方差分析及Tukey事后检验分析。(l) Pro-RNPs和Pro-RAD在10% FBS中孵育48小时后的血清稳定性。(m) Pro-RAD的高角环形暗场扫描TEM图像及相应元素分布分析。

图3

图4

Pro-GRAD的细胞摄取与内吞途径验证。(a) 不同孵育时间后PANC-1细胞对(i)非AS1411-Pro-GRAD和(ii) Pro-GRAD细胞摄取的CLSM分析。(b) a中Cy5荧光强度的定量统计。(c) 不同孵育时间后PANC-1细胞对(i)和(ii)细胞摄取的FCM分析。(d) c中Cy5荧光强度的定量统计。(e) 不同内吞途径抑制剂预处理后Pro-GRAD细胞摄取的FCM分析。(f) PANC-1细胞对Pro-GRAD拟议细胞内吞途径的示意图。(g) PANC-1细胞中Pro-GRAD（红色）和溶酶体（绿色）的共定位分析。数据以均值±SD表示，n=3，****p < 0.0001。数据通过双尾t检验分析。

图5

总结

胰腺癌基因治疗受限于递送平台的有效载荷泄漏和免疫原性。我们构建了基于滚环复制的酸激活核酸纳米前药，将Cas12a/crRNA核糖核蛋白与反义寡核苷酸整合于同一组装体。该前药表面包覆酸降解聚合物，进入肿瘤细胞后在酸性溶酶体中触发HhaI酶释放并切割识别位点，同时核糖核酸酶H水解RNA链，双重切割破坏组装体，高效共释放ASO和Cas12a/crRNA，实现精准基因沉默和编辑。在胰腺癌小鼠中抗肿瘤活性强，全身毒性和免疫原性极低。

参考文献：

DOI: 10.1002/adma.75257

我们专注纳米医学领域功能材料定制。可依据您的实验需求，定向开发生物功能纳米材料，调控材料结构、粒径与表面修饰，配套全套表征测试。方案可反复优化，全程技术对接，支撑靶向递送、生物成像、纳米诊疗等相关科研项目。欢迎提供指标需求，我们评估定制方案。

张工17715390137     陈工18914047343