Nature Nanotech：新型荧光DNA纳米器件再获新突破，揭示细胞的内部生命！

对于任何细胞而言，膜电位都是非常重要的生物学指标，尽管细胞膜电位易于测定，但是细胞器膜电位却不易测得。在以往的测定方法中，基于蛋白质的电压指示器固然强大，却无法在酸性条件下发挥作用；电压敏感性染料有着低电容性负载和PH不敏感的优点，但是无法被定位在细胞器上。

成果简介：
鉴于此，芝加哥大学Yamuna Krishnan教授开发出一种测定细胞器膜电位的新型荧光DNA纳米器件——Voltair，它结合了上文二者的优点，不需要侵入细胞器即可测得绝对膜电位，并且可以靶向活细胞中的细胞器。成果发表于Nature Nanotechnology上。

Voltair的构造：
Voltair包括一个电压敏感荧光团和一个作为内吞示踪剂、用于比率测定的参考荧光团。Voltair由38个碱基对的双链DNA构成，包括三个模块——Dv、Da、Dt。

1）首先，Dv是由38个核苷酸组成的单链DNA，其3’端被修饰了电压敏感性染料（RVF，绿色）,RVF具有很高的光稳定性，并且对PH不敏感，故而可以用于测定不同PH的细胞器膜电位。

2）其次，Da是参考探针（Atto647N，红色）附着于Da的5’末端，用于校正由于探针分布不均匀而引起的传感器分布差异所导致的强度差异。

3）最后，Dt是“靶向”组件，用于靶向特定的细胞器，其5’末端的POPE通过四乙二醇锚定在细胞器膜上。

Voltair的构造及其膜电位的伪彩图像

Voltair靶向特定的内吞细胞器的膜：
Voltair（红色通道）利用双链DNA成为清道夫受体的配体，从而标记细胞内的细胞器。DNA双链结合细胞膜上受体（绿色通道），并通过清道夫受体介导的内吞作用从质膜到早期内质体、晚期内质体和溶酶体。

Voltair靶向特定的内吞细胞器的膜

Voltair测定溶酶体膜电位：
利用清道夫受体介导的内吞作用，将Voltair靶向溶酶体。由于HEK 293T细胞不表达清道夫受体，通过瞬时转染的方法在HEK 293T细胞中过度表达了与CFP融合的人巨噬细胞清道夫受体（hMSR1）。发现了有效的Voltair摄取。hMSR1-CFP和VoltairIM之间的共定位以及竞争实验表明，VoltairI的摄取是由清道夫受体介导的。

此外，研究者还探究了Voltair是否可以检测到药理因素对溶酶体膜电位的影响。用巴弗洛霉素A1阻断V型质子泵，可以观察到膜电位的急剧下降，与静息电位相比下降了大约100mV。在之后的实验中，团队还探究了维持溶酶体膜电位的离子通道。对于早期和中期内体，通过Voltair测得其膜电位分别为+153mv和+114mV；其内Ca2+和Cl-浓度相近，但是中期内体的H+浓度则显著高于早期内体。这说明维持内体（溶酶体）膜电位的离子除却H+外， Na+和K+对溶酶体较高膜电位的维持发挥重要作用。

Voltair测定溶酶体膜电位及膜电位影响因素

溶酶体膜电位变化的延时成像：
为了测试Voltair是否可以提供时间信息，对溶酶体的膜电位变化进行了延时成像。细胞质Ca2 +的含量受到各种细胞器的严格调节，例如内质网，线粒体和质膜。还假设溶酶体可以缓冲细胞溶质中的Ca2 +，Ca2 +升高时，预计会干扰溶酶体的电化学稳态。因此，使用ATP升高了胞质Ca2 +，并测量了COS-7细胞中胞质Ca2 +的溶酶体的膜电位水平。细胞外ATP通过与质膜上的P2嘌呤能受体相互作用来提高胞质Ca2+。通过对全细胞强度图像中的Fluo-4和Voltair标记的细胞进行连续成像，监测了随时间变化的胞质Ca2+和溶酶体的膜电位水平。发现溶酶体的膜电位水平恢复与胞质Ca2+恢复同时发生。胞质Ca2+激增与突变的溶酶体超极化之间的相关性表明，溶酶体转运蛋白的激活与细胞的其他Ca2+缓冲细胞器一起，有助于恢复胞质Ca2+。

展望：
虽然Voltair在细胞器膜电位测定方面去的了突破性进展，但仍有不足。它只可以测定通过内吞作用形成的细胞器，如果想要测定更小的囊泡的膜电位或者是通过分泌途径产生的囊泡的膜电位，则需要更加精密的图像及器件。其次，如果该DNA纳米分析器件可以用于测定可兴奋性组织的膜电位，将会大大增加其适用范围。

参考文献：
Anand Saminathan, et al. A DNA-based voltmeter for organelles. Nat. Nanotechnol. (2020).
https://doi.org/10.1038/ s41565-020-00784-1
文章来源于：奇物论
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