学术前沿
3D生物打印含血小板衍生物的颗粒状水凝胶
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详细介绍
组织是具有层次结构的，由具有生物活性的动态细胞外基质和多个细胞群组成。细胞外基质成分相互连接，以建立独特的成分和拓扑结构，为细胞提供结构和生物化学上的支持以及调控细胞行为（如增殖、生长、迁移、分化）。此外，细胞外基质还可以动态地和局部地调节可溶性和固定化分子的释放。水凝胶由于其水合网络和独特的理化性质可以调节细胞行为，常被用做细胞外基质的模拟物。微凝胶是一种通过自下而上工程策略制备的新型墨水。与传统的块状水凝胶相比，微凝胶具有显著的孔隙率、增加的比表面积、模块化以及优良的可控机械响应。
近期，美国宾夕法尼亚大学生物工程系Jason A. Burdick教授团队将可光交联的降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）与人血小板裂解物（PL）结合起来，结合微流控技术制备了具有层次化纤维网络的球形PL-NorHA微凝胶。这种微凝胶具有剪切变稀和自愈特性，可以通过3D打印技术制造稳定的3D结构。相关研究论文：“Injectable hyaluronic acid and platelet lysate-derived granular hydrogels for biomedical applications”发表于Acta Biomaterialia上。
工艺：PL-NorHA水凝胶的合成：NorHA与PL基质在室温下孵育20min，然后可见光固化5min，以形成PL-NorHA水凝胶。
PL-NorHA微凝胶的制备：将前驱液1(NorHA或含凝血因子的NorHA)和前驱液2(PBS或PL)分别以1μl/min和2μl/min的流速导入微流控设备。在出口处(≈28 cm)，启动凝胶，然后经可见光固化形成聚合物液滴。
1. PL-NorHA水凝胶的表征为了分析PL-NorHA水凝胶的纤维结构，研究者将荧光纤维蛋白原加入PL溶液中，并用共聚焦显微镜观察。图2A-i,ii显示，当NorHA浓度为1%和2%时，水凝胶显示出类似于典型的分层纤维基质的相互连接和均匀的纤维结构。这种多尺度属性的引入重现了天然ECM从纳米尺度到微米尺度的分级组织的复杂性。为了更好的了解所得水凝胶的凝胶动力学和网络特性，研究者分析了它们的凝胶过程和粘弹特性(图2b-i~iv)。在可见光照射前(20min)，NorHA、NorHA蛋白(即不加凝血剂)和PL-NorHA(即添加凝血剂)具有较低的储存模量，其机制相似(G’≈1-2Pa和G’’≈0.4-1Pa)。然而，当暴露在可见光下时，由于硫醇-烯反应的共价光交联反应，弹性模量和粘性模量增加，并在几秒钟内达到储存模量平台(2b-i-iv)。PL-NorHA水凝胶(G’：593±156Pa-1wt.%和G’：3536±159Pa-2wt.%)比仅含NorHA(G’：1655±238Pa-1wt.%和G’：4845±376Pa-2wt.%)或含有蛋白质的NorHA水凝胶(G’：1561±75Pa-1wt.%和G’：5324±722Pa-2wt.%)具有更低的储能模量。
2. PL-NorHA水凝胶中蛋白质的释放HA的生物合成和组织周转受合成酶和透明质酸酶的调节。研究者利用对水凝胶中糖醛酸或总蛋白的量化，绘制了水凝胶的体外降解曲线(图2C)。研究发现，在透明质酸酶存在的情况下，水凝胶的总降解时间和降解速度更快。降解时间与交联密度之间也存在相关性，高浓度(2wt.%)的降解速度慢于低浓度(1wt.%)。此外，PL-NorHA水凝胶的降解速度比NorHA快(图2c- i,iii)。这是由于PL-NorHA水凝胶除了共价光交联网络(NorHA)外，还含有交联的PL蛋白结合的纤维基质。因此，PL-NorHA水凝胶的降解不仅是由于糖醛酸的释放（代表HA降解），也与纤维蛋白基质的降解有关。1wt.%的PL-NorHA水凝胶(92±1%)比2wt.% PL-NorHA水凝胶(72±2%)具有更高的PL衍生蛋白释放。这些结果表明，HA大分子浓度和纤维蛋白基质的不同组合，可以调节载药水凝胶中药物的释放。
4. 微凝胶的制备及表征将含有凝血因子的NorHA(凝血因子)和PL以不同的流量比通过两个独立的通道引入到Y形微流控芯片中，汇聚成一个层流的通道以促进纤维蛋白的聚合。然后，这个单一通道被不相容的连续相截断，产生油包水液滴。经过蛇形路径时，纤维蛋白进一步聚合，在通道末端经可见光交联，形成微凝胶（如图4a）。研究者在微凝胶形成过程中掺入荧光素标记的葡萄糖，以分析其形态（包括大小和圆度）(图4b，c)。PL-NorHA微凝胶产生了均一和分层的纤维蛋白网络(图4b- ii)。球形微凝胶的平均直径分别为120±12μm(1wt.%NorHA)、126±17μm(1wt.%PL-NorHA)、100±8μm(2 wt.%NorHA)和119±21μm(2 wt.%PL-NorHA)(图4c-i,ii)。通过糖醛酸和总蛋白的释放，研究者对微凝胶的降解进行评估。研究发现，微凝胶在透明质酸酶存在时表现出降解趋势，且浓度低的微凝胶比浓度高的微凝胶降解速度更快；PL-NorHA微凝胶的降解速度比NorHA微凝胶更快；微凝胶状态的降解速度比水凝胶状态更快(图4d-i, iii)。对总蛋白释放定量，发现7天后，在有或无透明质酸酶的作用下，PL-NorHA的总蛋白释放量分别为41%±7%和69%±3%。综上研究表明，微凝胶的稳定性和治疗相关蛋白的释放速率可以通过改变交联密度以及透明质酸酶浓度来调整。
5. 颗粒水凝胶的流变特性为了研究微凝胶的可打印性，研究者评估了微凝胶的流变特性和结构(图5)。振荡剪切流变实验结果表明，当NorHA聚合物在微凝胶中的浓度从1%增加到2%时，颗粒水凝胶的储存模量增加了一个数量级(图5a-I, iv)。与在水凝胶中的观察结果一致，PL的存在显著降低了颗粒水凝胶的存储模量(分别从77±3Pa降至234±2Pa，2wt.%NorHA和PL-NorHA)。微凝胶具有剪切稀释性和自愈性的流变特性，可以在不改变初始性能的情况下以最小的力挤出。从不同浓度的微凝胶(1wt.%和2wt.%)制备的颗粒状水凝胶都随着应变的增加而表现出剪切屈服(图5a-ii，v)。通过一系列高(500%)和低(0.5%)应变扫描，观察到所有颗粒水凝胶的自恢复行为。在受到高应变后，材料表现出快速的类固体行为恢复(图5a-iii，vi)。为了更好地观察颗粒水凝胶的结构，研究者在制作油包水液滴前将微凝胶与罗丹明硫醇孵育以进行可视化。结果表明，1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝胶显示出非常小的孔隙率，而2wt.%PL-NorHA微凝胶增加了孔隙率，2wt.%NorHA微凝胶的孔隙率最大。这可能是由于微凝胶的粘弹性造成的。微凝胶的低力学挤压增加了它们的堆积密度，且减小了表面积（图5B）。
6. 3D打印颗粒水凝胶及其体外细胞响应为了评估微凝胶墨水的可打印性，研究者将含有FITC-葡聚糖的微凝胶呈细丝状打印在载玻片表面，并用荧光显微镜观察(图6a)。由于其颗粒状结构，微凝胶墨水很容易挤出形成均匀的细丝，呈现密集堆积的微凝胶形态。进一步，研究者使用微凝胶墨水进行3D打印以制造3D构造(图6b-i)。浓度较低的微凝胶墨水产生稳定的3D结构(图6b-ii, iii, v)，浓度较高的NorHA微凝胶产生的结构容易破坏(图6b-iv)。除了结构的完整性，打印的结构也显示出高保真度。随后研究者使用负载MSCs细胞的1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝胶进行3D打印。生长在NorHA微凝胶上的MSCs显示出圆形的形态(图6c-i)，类似于NorHA水凝胶得到的结果；而PL-NorHA微凝胶中相互连接的微孔空间促进了MSCs细胞的大量迁移与3D细胞网络的形成(图6c-i, iii)。这表明PL衍生蛋白可以促进细胞黏附和存活，并且可以形成可提供细胞锚点的分级纤维蛋白网络。
近期，美国宾夕法尼亚大学生物工程系Jason A. Burdick教授团队将可光交联的降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）与人血小板裂解物（PL）结合起来，结合微流控技术制备了具有层次化纤维网络的球形PL-NorHA微凝胶。这种微凝胶具有剪切变稀和自愈特性，可以通过3D打印技术制造稳定的3D结构。相关研究论文：“Injectable hyaluronic acid and platelet lysate-derived granular hydrogels for biomedical applications”发表于Acta Biomaterialia上。
图1 PL-NorHA水凝胶和微凝胶的制备
凝胶材料：可光交联的降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）工艺：PL-NorHA水凝胶的合成：NorHA与PL基质在室温下孵育20min，然后可见光固化5min，以形成PL-NorHA水凝胶。
PL-NorHA微凝胶的制备：将前驱液1(NorHA或含凝血因子的NorHA)和前驱液2(PBS或PL)分别以1μl/min和2μl/min的流速导入微流控设备。在出口处(≈28 cm)，启动凝胶，然后经可见光固化形成聚合物液滴。
1. PL-NorHA水凝胶的表征为了分析PL-NorHA水凝胶的纤维结构，研究者将荧光纤维蛋白原加入PL溶液中，并用共聚焦显微镜观察。图2A-i,ii显示，当NorHA浓度为1%和2%时，水凝胶显示出类似于典型的分层纤维基质的相互连接和均匀的纤维结构。这种多尺度属性的引入重现了天然ECM从纳米尺度到微米尺度的分级组织的复杂性。为了更好的了解所得水凝胶的凝胶动力学和网络特性，研究者分析了它们的凝胶过程和粘弹特性(图2b-i~iv)。在可见光照射前(20min)，NorHA、NorHA蛋白(即不加凝血剂)和PL-NorHA(即添加凝血剂)具有较低的储存模量，其机制相似(G’≈1-2Pa和G’’≈0.4-1Pa)。然而，当暴露在可见光下时，由于硫醇-烯反应的共价光交联反应，弹性模量和粘性模量增加，并在几秒钟内达到储存模量平台(2b-i-iv)。PL-NorHA水凝胶(G’：593±156Pa-1wt.%和G’：3536±159Pa-2wt.%)比仅含NorHA(G’：1655±238Pa-1wt.%和G’：4845±376Pa-2wt.%)或含有蛋白质的NorHA水凝胶(G’：1561±75Pa-1wt.%和G’：5324±722Pa-2wt.%)具有更低的储能模量。
2. PL-NorHA水凝胶中蛋白质的释放HA的生物合成和组织周转受合成酶和透明质酸酶的调节。研究者利用对水凝胶中糖醛酸或总蛋白的量化，绘制了水凝胶的体外降解曲线(图2C)。研究发现，在透明质酸酶存在的情况下，水凝胶的总降解时间和降解速度更快。降解时间与交联密度之间也存在相关性，高浓度(2wt.%)的降解速度慢于低浓度(1wt.%)。此外，PL-NorHA水凝胶的降解速度比NorHA快(图2c- i,iii)。这是由于PL-NorHA水凝胶除了共价光交联网络(NorHA)外，还含有交联的PL蛋白结合的纤维基质。因此，PL-NorHA水凝胶的降解不仅是由于糖醛酸的释放（代表HA降解），也与纤维蛋白基质的降解有关。1wt.%的PL-NorHA水凝胶(92±1%)比2wt.% PL-NorHA水凝胶(72±2%)具有更高的PL衍生蛋白释放。这些结果表明，HA大分子浓度和纤维蛋白基质的不同组合，可以调节载药水凝胶中药物的释放。
图2 PL-NorHA水凝胶的机械性能和降解性能表征 3. MSCs细胞对PL-NorHA水凝胶的体外反应研究者将MSCs细胞在无血清条件下接种于NorHA、NorHA-RGD和PL-NorHA水凝胶上，体外培养4h和1d后观察细胞形态。接种在NorHA水凝胶上的细胞通常表现出圆形形态，在1wt.%和2wt.%的浓度下有一些突起，随着时间的推移显示出可比的细胞铺展面积和纵横比(图3a)。1wt.%和2wt.%NorHA-RGD组水凝胶可以极大的增加细胞铺展面积。在PL-NorHA水凝胶(1wt.%和2wt.%)中细胞在培养仅4小时后就粘附、铺展并呈现纺锤状形态(图3a，b)。培养1d后，MSCs呈细长突起，与相邻细胞形成相互连接的网络。这些变化可能是PL-NorHA水凝胶形成的纤维状网络造成的。它不仅提供了一个临时的层次化的细胞外基质，给予机械支持和细胞外基质拓扑结构，而且还包含许多结合结构域，介导与细胞、细胞外基质蛋白和生长因子之间相互作用。
图3 PL-NorHA水凝胶的体外细胞活性评价
4. 微凝胶的制备及表征将含有凝血因子的NorHA(凝血因子)和PL以不同的流量比通过两个独立的通道引入到Y形微流控芯片中，汇聚成一个层流的通道以促进纤维蛋白的聚合。然后，这个单一通道被不相容的连续相截断，产生油包水液滴。经过蛇形路径时，纤维蛋白进一步聚合，在通道末端经可见光交联，形成微凝胶（如图4a）。研究者在微凝胶形成过程中掺入荧光素标记的葡萄糖，以分析其形态（包括大小和圆度）(图4b，c)。PL-NorHA微凝胶产生了均一和分层的纤维蛋白网络(图4b- ii)。球形微凝胶的平均直径分别为120±12μm(1wt.%NorHA)、126±17μm(1wt.%PL-NorHA)、100±8μm(2 wt.%NorHA)和119±21μm(2 wt.%PL-NorHA)(图4c-i,ii)。通过糖醛酸和总蛋白的释放，研究者对微凝胶的降解进行评估。研究发现，微凝胶在透明质酸酶存在时表现出降解趋势，且浓度低的微凝胶比浓度高的微凝胶降解速度更快；PL-NorHA微凝胶的降解速度比NorHA微凝胶更快；微凝胶状态的降解速度比水凝胶状态更快(图4d-i, iii)。对总蛋白释放定量，发现7天后，在有或无透明质酸酶的作用下，PL-NorHA的总蛋白释放量分别为41%±7%和69%±3%。综上研究表明，微凝胶的稳定性和治疗相关蛋白的释放速率可以通过改变交联密度以及透明质酸酶浓度来调整。
图4 PL-NorHA微凝胶的制备与表征
5. 颗粒水凝胶的流变特性为了研究微凝胶的可打印性，研究者评估了微凝胶的流变特性和结构(图5)。振荡剪切流变实验结果表明，当NorHA聚合物在微凝胶中的浓度从1%增加到2%时，颗粒水凝胶的储存模量增加了一个数量级(图5a-I, iv)。与在水凝胶中的观察结果一致，PL的存在显著降低了颗粒水凝胶的存储模量(分别从77±3Pa降至234±2Pa，2wt.%NorHA和PL-NorHA)。微凝胶具有剪切稀释性和自愈性的流变特性，可以在不改变初始性能的情况下以最小的力挤出。从不同浓度的微凝胶(1wt.%和2wt.%)制备的颗粒状水凝胶都随着应变的增加而表现出剪切屈服(图5a-ii，v)。通过一系列高(500%)和低(0.5%)应变扫描，观察到所有颗粒水凝胶的自恢复行为。在受到高应变后，材料表现出快速的类固体行为恢复(图5a-iii，vi)。为了更好地观察颗粒水凝胶的结构，研究者在制作油包水液滴前将微凝胶与罗丹明硫醇孵育以进行可视化。结果表明，1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝胶显示出非常小的孔隙率，而2wt.%PL-NorHA微凝胶增加了孔隙率，2wt.%NorHA微凝胶的孔隙率最大。这可能是由于微凝胶的粘弹性造成的。微凝胶的低力学挤压增加了它们的堆积密度，且减小了表面积（图5B）。
图5 PL-NorHA颗粒状水凝胶的流变性和形态表征
6. 3D打印颗粒水凝胶及其体外细胞响应为了评估微凝胶墨水的可打印性，研究者将含有FITC-葡聚糖的微凝胶呈细丝状打印在载玻片表面，并用荧光显微镜观察(图6a)。由于其颗粒状结构，微凝胶墨水很容易挤出形成均匀的细丝，呈现密集堆积的微凝胶形态。进一步，研究者使用微凝胶墨水进行3D打印以制造3D构造(图6b-i)。浓度较低的微凝胶墨水产生稳定的3D结构(图6b-ii, iii, v)，浓度较高的NorHA微凝胶产生的结构容易破坏(图6b-iv)。除了结构的完整性，打印的结构也显示出高保真度。随后研究者使用负载MSCs细胞的1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝胶进行3D打印。生长在NorHA微凝胶上的MSCs显示出圆形的形态(图6c-i)，类似于NorHA水凝胶得到的结果；而PL-NorHA微凝胶中相互连接的微孔空间促进了MSCs细胞的大量迁移与3D细胞网络的形成(图6c-i, iii)。这表明PL衍生蛋白可以促进细胞黏附和存活，并且可以形成可提供细胞锚点的分级纤维蛋白网络。
图6 3D打印结构稳定性及PL-NorHA微凝胶的体外细胞活性评价。
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