Adv. Funct. Mater. | 基于微流控技术的催化纳米海绵：通过靶向NETs为卵巢早衰提供协同治疗新策略

卵巢早衰（POI）是导致女性不孕和内分泌功能障碍的重要原因，其定义为40岁前卵巢功能丧失。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在卵巢早衰的发病机制中起着关键作用，因其可促进细胞因子释放，导致氧化应激、炎症及纤维化，从而引发卵巢功能障碍。因此，NETs是卵巢早衰治疗的潜在靶点。然而，目前针对NETs降解的研究仍然有限。
南通大学附属医院朱玉娟教授团队提出一种基于微流控技术的仿生催化纳米海绵（DENase@Ce），作为潜在的抗NETs疗法用于卵巢早衰治疗（图1）。表面覆盖阳离子聚合物的纳米海绵可通过电荷捕获效应吸附NETs，随后被外表面共轭的DNA酶Ⅰ降解。为从根本上缓解招募并激活中性粒细胞的炎性微环境，该纳米海绵展现出固有的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及抑制羟基自由基的活性，能有效降低过量的活性氧，从而抑制NETs的进一步形成。体内研究表明，注射催化纳米海绵可改善环磷酰胺诱导的卵巢早衰小鼠的卵巢功能，表现为卵巢重量增加、卵泡数量改善及生育能力恢复。本工作构建了一种新型协同抗NETs策略，并为解决化疗引起的生育功能损伤提供了潜在的治疗平台。图1 (a) 基于微流控技术的纳米海绵制备过程示意图；(b) 催化纳米海绵作为抗NETs疗法用于恢复卵巢功能的机制示意图。
该研究通过微流控技术制备DENase@Ce纳米海绵，其介孔铈纳米酶核心（约80 nm）经树枝状聚合物修饰及DNase I共价偶联后形成约120 nm的球形结构，DNase I负载量约为7.2%（图2）。鲱鱼骨微通道产生的混沌对流显著提高了组装效率，尺寸与电位变化证实了纳米复合物的成功构建。该纳米海绵在溶液中表现出良好的稳定性，为其后续生物应用奠定了基础。图2. DENase@Ce的表征。(a) 微流控芯片内流体动力学模拟分析。(b) CeNP、DEN@Ce及DENase@Ce的TEM与SEM图像。(c) 粒径分析。(d) DENase@Ce的元素分布图像。(e) CeNP、DEN@Ce及DENase@Ce的粒径分布与(f) Zeta电位。
此外本研究评估了纳米颗粒的酶模拟活性（图3）。CeNP、DEN@Ce及DENase@Ce均表现出与过氧化氢酶（CAT）、羟自由基（•OH）抑制及超氧化物歧化酶（SOD）相当的催化活性。值得注意的是，DENase@Ce的催化活性呈现浓度依赖性，表明其在清除与卵巢早衰发病机制相关的活性氧方面具有显著潜力。为评估纳米海绵的ROS清除能力，采用ROS探针（DCFH-DA）标记经脂多糖预处理的RAW264.7细胞内的ROS。与对照组相比，LPS处理显著增强了细胞内的ROS荧光信号。而经DENase@Ce孵育后，尤其在较高浓度下，ROS荧光信号急剧下降。进一步的流式细胞术定量分析显示，随着DENase@Ce浓度增加，LPS预处理RAW264.7细胞的DCF荧光信号逐渐减弱，证实DENase@Ce能以浓度依赖方式有效清除ROS。图3. DENase@Ce的抗氧化性能。(a) 不同浓度纳米颗粒的过氧化氢酶活性、(b) 羟自由基抑制活性及(c) 超氧化物歧化酶活性评估。(d) 经不同浓度DENase@Ce孵育24小时后，LPS预处理RAW264.7细胞内ROS的DCF荧光代表性图像。 (e) 不同浓度DENase@Ce处理24小时后，DCF荧光的流式细胞术分析。(f) 不同浓度DENase@Ce孵育后，DCF阳性RAW264.7细胞显示的相对ROS水平（n=3）。

巨噬细胞作为卵巢常驻免疫细胞，在调节卵巢功能中发挥复杂作用。在卵巢早衰中，巨噬细胞过度活化会释放多种炎性因子，形成促进中性粒细胞募集、活化及NETs形成的微环境，进而破坏卵巢结构并损害其功能。为此，研究者通过分析体外M1/M2巨噬细胞亚群平衡，研究DENase@Ce对巨噬细胞极化的影响（图4）。流式细胞术分析显示，DENase@Ce处理可降低由LPS预处理的分化的M1型巨噬细胞（F4/80+CD86+）比例，该亚群可诱导卵巢组织炎症反应。随着DENase@Ce浓度升高，M1型巨噬细胞比例最低降至8.17%。相反，主要发挥抑制炎症、促进组织修复作用的M2型巨噬细胞（F4/80+CD206+）在DENase@Ce处理后呈浓度依赖性上调，较对照组升高近2.4倍（17.1% vs 41.1%）。为进一步验证纳米海绵对巨噬细胞极化的调控作用，采用ELISA检测不同浓度DENase@Ce处理的M1型巨噬细胞分泌的炎性因子。IL-6、IL-1β和TNF-α水平随DENase@Ce浓度增加逐渐下降。以上数据表明，DENase@Ce能够抑制巨噬细胞促炎表型，有助于遏制中性粒细胞活化及NETs形成。图4. DENase@Ce纳米海绵对巨噬细胞表型的调控作用。(a) DENase@Ce对M1型巨噬细胞（LPS处理的RAW264.7细胞）的影响及(b) 流式细胞术定量结果（n=3）。(c) DENase@Ce对M0型巨噬细胞（未经LPS处理的RAW264.7细胞）的影响及(d) 流式细胞术定量结果（n=3）。不同浓度DENase@Ce处理LPS激活的RAW264.7细胞后，(e) IL-6、(f) IL-1β及(g) TNF-α的表达水平（n=3）。

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原文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202522326?sessionid=